WJSC | 经血来源间充质干细胞移植治疗宫腔粘连的安全性研究

译者：贾瀛娴¹ 刘阳²

单位：1.浙江大学医学院附属妇产科医院

2.上海市第一妇婴保健院

前言宫内粘连（IUA）是一种主要与宫内操作相关的创伤性疾病，其主要特征是子宫内膜功能障碍，包括月经异常（月经减少或闭经）、子宫内膜菲薄、骨盆疼痛、胚胎植入异常、不孕和流产。其发生率随着宫内操作频率的增加而逐渐上升。据统计，大约2.8-45.5％的继发不孕与IUA有关。但是，常规治疗（如：宫腔分离和激素补充治疗）对于重度IUA的患者无法达到满意的疗效，特别是难以提高IUA患者的生育力。
最近的研究表明，干细胞移植可以有效修复组织和器官损伤。间充质干细胞（MSCs）可轻松地从组织和器官中获得，具有增殖能力强、遗传稳定性高、趋化特性和免疫遗传作用低等优点，在再生医学领域中起着重要的作用。近来，MSCs已用于不孕症的治疗中。骨髓来源的MSCs（BMSCs），脐带来源的MSCs（UCMSCs）和子宫内膜来源的MSCs均被证明可有效修复受损的子宫内膜。
经血来源的间充质干细胞（MenSCs）来源于经血中脱落的子宫内膜干细胞，具有典型的MSC特性，如：自我克隆、快速增殖和多能性。MenSCs已证明可改善多种疾病（如：1型糖尿病，肝病，卵巢早衰，骨软骨缺损，心脏病和软骨损伤）。值得注意的是，MenSCs可以较容易地以无创方式从废弃经血中获得，可以周期性获取并自体移植，而不引起创伤或伦理风险。因此，与BMSCs和脂肪组织间充质干细胞（ADSCs）相比，MenSCs具有更大的临床应用潜力。既往研究证实，自体MenSCs移植可促进患者的子宫内膜形态改善和功能恢复，从而获得妊娠。因此，MenSCs移植在治疗子宫内膜损伤方面具有潜力。
虽然，MenSCs在治疗创伤性疾病中有效性已被证实，但其尚缺乏有关MenSCs临床应用的长期随访数据，缺乏系统的生物安全性评估。本研究通过大鼠宫内移植模型，评价MenSCs宫内移植治疗的短期、中期和长期生物安全性，重点考察其毒性和致瘤性，为MenSCs在子宫内膜损伤治疗中的临床应用提供了理论基础。

方法1. 培养和鉴定MenSCs经血来源于3名健康的志愿者，年龄在25-30岁。MenSCs培养3代后通过流式细胞术鉴定MSC表面标志物（CD34,CD38,CD44,CD45,CD73,CD90和CD105）。
2. 毒性实验IUA大鼠模型的建立和干预：选择30只处于发情期的雌性Sprague-Dawley大鼠进行手术（n＝10/组）。经麻醉后，手术暴露子宫角，使用16G注射器机械损伤子宫内膜。经过2个发情周期后，重新打开腹壁，向每个子宫浆膜层注入5×10⁵个单位的MenSCs。每组中5只大鼠接受安慰剂（PBS）注射作为对照。
样本采集：根据观察时间分为3个实验组：急性期组（3天），亚慢性期组（3个月）和慢性期组（6个月）。所有大鼠处死前称重，并经腹主动脉收集5mL外周血，分别进行全血血细胞成分分析（包括：红细胞、血细胞比容、血红蛋白、平均红细胞体积、平均血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、网状细胞、白细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞以及血小板相关的浓度或百分比）和生化检测（包括：血糖、尿素、肌酐、总蛋白、白蛋白、球蛋白、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶以及钠、钾和氯离子浓度）。除去表面脂肪、称重大鼠的脑、心脏、肝、脾、肺、肾、胸腺、肾上腺、子宫和卵巢，并记录，之后进行组织病理学分析（HE染色）。
3. 致瘤性实验体内：第三代的MenSCs经过绿色荧光蛋白（GFP）标记的慢病毒进行转染，并在Balb/c-nu裸鼠中皮下注射。
体外：MenSCs的致瘤性是通过体外琼脂菌落形成实验，HELA细胞作阳性对照。
统计学所有数据均以平均值±标准差表示，并使用单向方差分析（ANOVA）进行组间比较。使用Prism8软件（GraphPad），进行统计分析，P<0.05被认为具有统计学差异。

结果毒性实验体重：在整个实验期间，对照组和MenSCs移植组均未见死亡或不良反应。大鼠表现均正常，无手术并发症。实验组与对照组之间体重无显著差异（P_急性= 0.207，P_亚慢性=0.255，P_慢性=0.696）。
器官重量：对照组和治疗组在脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、胸腺、肾上腺、子宫和卵巢的相对重量无差异，且均在正常范围；所有器官均未见形态或颜色变化。
血液学和生物化学：MenSCs移植组的血细胞组成略有波动，但均在正常值范围内。另外，与同龄对照相比，MenSCs移植组的血清生化或代谢指标均无差异。
组织病理学与同周龄的对照组相比，MenSCs移植组的主要器官形态或大小无变化。此外，在MenSCs移植后3天、3个月或6个月内均未见子宫内膜异位病灶或肿瘤形成。
对主要脏器进行HE染色组织病理学检查发现，与同龄对照组相比，MenSCs移植组无明显的结构改变或肿瘤形成。
致瘤性实验体内实验：MenSCs注射4周后，裸鼠无肿瘤形成，且荧光标记的MenSCs随着时间逐渐消失，且在其他部位也未检测到荧光信号。而阳性对照（HELA细胞）注射的Balb/c-nu小鼠形成皮下肿瘤并产生表面坏疽。体外实验：体外培养MenSCs，培养2周内未见克隆形成。阳性对照Hela细胞在琼脂中形成多个克隆，成堆生长并向外扩散，具有很强的致瘤性。

讨论间充质干细胞（MSCs）在基础和临床研究中应用最广泛的干细胞。MSCs除了具有分化潜能外，还参与免疫平衡的调节。此外，MSCs能形成微环境，有利于组织再生。最近的临床研究已经证实MSCs在改善器官功能和组织再生方面具有治疗作用，被广泛应用于心血管疾病、免疫系统疾病、运动系统损伤和消化系统疾病的临床治疗研究。在这些临床研究的随访中，没有报告发生肿瘤或与干细胞移植相关的严重并发症。
到目前为止，只有两项临床试验涉及MenSCs的报道未观察到与免疫反应和细胞移植相关的并发症。
目前，MenSCs治疗研究大多处于临床前或一期临床研究阶段。要将MenSCs从实验产品向临床治疗转化，必须考虑临床应用直接相关的因素，如适应证、给药途径、剂量等。由于干细胞具有高增殖潜能和多能性，其细胞毒性和致瘤性是临床研究关注的主要问题。同时，应在适当的体内和体外模型中评估其生物安全性。在本研究中，我们采用与临床应用相一致的剂量和方法，将MenSCs移植到IUA大鼠模型中，并评估急性、亚慢性和慢性观察MenSCs的安全性。本研究是首次对MenSCs进行全面的临床前生物安全性研究。
本研究中的所有大鼠模型在干细胞移植后3天至6个月内均保持正常体重，无死亡、行为异常或移植相关疾病，大鼠主要器官的重量、形状和外观均保持正常。此外，与对照组相比，MenSC移植后的血细胞组成及比例、肝肾功能均无差异。以上结果表明MenSCs耐受性良好，未引起异常免疫反应或器官功能障碍。
研究通过阴道无创性采集经血，是MenSCs在再生医学方面的独特优势。然而，这也是MenSCs制备过程中污染风险的主要来源。因此，建立质量控制体系对MenSCs的临床应用至关重要。
肿瘤发生是MSCs临床应用中可能发生的最严重的危险因素之一，与基因组不稳定性密切相关。只有少数研究表明，MSC移植部位发生恶性病变，提示肿瘤形成的潜在风险可能仍然存在。然而，一些其他研究认为，MSCs经过静脉或肌肉注射后与肿瘤发生无关。在本研究中，子宫浆膜下MenSCs移植后6个月的IUA大鼠模型未见肿瘤形成，腹壁或器官均无肿块形成；各器官的生理结构基本正常。此外，研究还利用Balb/c-nu裸鼠评估MenSCs的致瘤性。结果提示，皮下GFP荧光范围逐渐减小，无迁移。标记GFP荧光的MenSCs在第4周完全消失，表明在体内MenSCs是非致瘤性的。此外，体外琼脂实验表明，MenSCs在体外不形成任何肿瘤样细胞群。以上结果均为MenSCs的临床应用安全性提供良好证据。
总之，本研究证实宫内移植MenSCs是安全的，无毒性和致瘤性。结果表明，MenSCs不仅是安全的，而且为治疗IUA和其他类型子宫内膜损伤提供了潜在的细胞来源。此外，还需要对接受移植的患者进行更长时间的跟踪随访，以充分保证MenSCs应用的安全性。

参考文献：

[1] March CM, Israel R, March AD. Hysteroscopic management of intrauterine adhesions. Am J Obstet Gynecol. 1978. 130(6): 653-7.

[2] Meng X, Ichim TE, Zhong J, et al. Endometrial regenerative cells: a novel stem cell population. J Transl Med. 2007. 5: 57.

[3] Chang QY, Zhang SW, Li PP, Yuan ZW, Tan JC. Safety of menstrual blood-derived stromal cell transplantation in treatment of intrauterine adhesion. World J Stem Cells. 2020. 12(5): 368-380.

[4] Squillaro T, Peluso G, Galderisi U. Clinical Trials With Mesenchymal Stem Cells: An Update. Cell Transplant. 2016. 25(5): 829-48.

[5] Tan J, Li P, Wang Q, et al. Autologous menstrual blood-derived stromal cells transplantation for severe Asherman's syndrome. Hum Reprod. 2016. 31(12): 2723-2729.

[6] Zhong Z, Patel AN, Ichim TE, et al. Feasibility investigation of allogeneic endometrial regenerative cells. J Transl Med. 2009. 7: 15.

责任编辑：Janice

听说微信又双叒叕改版

快把“妇产科网”设为星标吧

精品学术内容不再错过！

快来跟着步骤操作吧↓↓↓

推荐阅读：